Prêmio Nobel de Química 2006: Os Mecanismos Estruturais da Transcrição em Eucariotos

Mais uma vez a Academia Real Sueca de Ciências decidiu premiar na área de Química uma descoberta que apresenta um forte impacto para o estudo dos sistemas biológicos : o pesquisador Roger D. Kornberg foi agraciado com o prêmio Nobel de Química de 2006 pelos seus estudos sobre as bases moleculares da transcrição gênica em eucariotos. A freqüente premiação com o Nobel de Química de temas relacionados à Biologia ilustra a importância da integração interdisciplinar entre essas duas grandes áreas.

Roger Kornberg e seu pai, Arthur Kornberg

A informação genética contida no DNA é primeiramente convertida em RNA, que por sua vez é utilizado como molde para a síntese de proteínas. Roger Kornberg, um bioquímico e biologista estrutural da Escola Médica da Universidade de Stanford, descreveu pela primeira vez como o processo de conversão de DNA em RNA mensageiro, ou transcrição, ocorre do ponto de vista estrutural. A transcrição de genes é necessária durante toda a vida de um organismo, desde a sua formação até a sua manutenção, como por exemplo durante o desenvolvimento ou na reposição de células mortas. Compreender como a transcrição funciona também é fundamental do ponto de vista médico, já que distúrbios nos processos de transcrição estão relacionados a doenças como o câncer.

Os mecanismos de transcrição gênica em procariotos já eram bastante conhecidos nos anos 1960. A RNA polimerase de bactérias consiste de quatro subunidades centrais e uma quinta subunidade variável, denominada de fator sigma. A subunidade sigma é necessária para que a polimerase reconheça o promotor de um gene, uma seqüência específica de nucleotídeos que sinaliza o local de início da síntese de RNA. Em contraste com as bactérias, os eucariotos apresentam três tipos de RNA polimerase (I-III). Todos os genes codificadores de proteínas são transcritos pela RNA polimerase II, que foi o alvo de estudo de Kornberg. Durante os anos 1970, a RNA polimerase de eucariotos foi purificada e verificou-se que ela é constituída de doze subunidades. No entanto, nenhuma subunidade similar ao fator sigma foi identificada. Hoje sabemos que outros tipos de fatores cumprem o papel do fator sigma em eucariotos. Foram identificados cinco fatores as sociados à RNA polimerase II que estão envolvidos na transcrição de todos os genes, denominados de fatores gerais de transcrição. Com o auxílio desses fatores gerais de transcrição (TFIIB, D, E, F e H), a RNA polimerase II em eucariotos reconhece o sítio de início de transcrição e inicia a síntese de RNA.

A estrutura dos nucleossomos

Por muito tempo acreditou-se que o processo de transcrição em eucariotos ocorria de maneira muito similar ao de procariotos. Com o tempo, foi ficando claro que o processo de transcrição em eucariotos é muito mais complexo. Enquanto o DNA nas bactérias está exposto, o DNA eucariótico está organizado na forma de cromatina. Antes de iniciar seu trabalho sobre os mecanismos moleculares de transcrição, Kornberg estudou a estrutura da cromatina. Durante seu estágio de pós-doutorado, que foi realizado sob a orientação de Francis Crick e Aaron Klug, na Universidade de Cambr idge, na Inglaterra, ele propôs que a unidade básica da cromatina, o nucleossomo, é constituída de um octâmero de histonas e de 200 pares-base de DNA (Figura 1).

Naquela época, não se acreditava que a estrutura da cromatina apresentasse um papel importante na regulação da transcrição gênica. Desde então se descobriu que o empacotamento do DNA em nucleossomos apresenta uma grande importância na regulação da expressão gênica. A presença de nucleossomos nas regiões promotoras dos genes inibe a transcrição destes pela RNA polimerase II. Os nucleossomos então garantem que todos os genes eucarióticos estejam inativos, exceto aqueles cuja transcrição é ativada por mecanismos regulatórios específicos. Sabe-se que fatores de ativação tecido-específicos são capazes de se ligar a seqüências regulatórias presentes nos genes eucarióticos, denominadas de enhancers. Esses fatores são capazes de modificar as histonas nessas regiões, fazendo com que o DNA seja descompactado de forma que possa ser transcrito pela RNA polimerase II, fazendo, por exemplo, com que este gene seja transcrito em um tecido específico e não em outro.

Experimentos recentes indicam que os nucleossomos são completamente removidos da região promotora durante a transcrição em genes ativos, de forma que a RNA polimerase II pode interagir diretamente com o DNA. Após a transcrição, os nucleossomos são novamente formados. A modulação do estado de condensação da cromatina apresenta, portanto, um papel fundamental na regulação da expressão gênica, sendo que Kornberg teve uma importante participação nessa descoberta.

A descoberta do mediador

Uma outra grande contribuição de Roger Kornberg foi a de desenvolver um sistema para o estudo da transcrição in vitro que utilizava a levedura Saccharomyces cerevisae, que é um eucarioto, assim como são os mamíferos. Esse organismo-modelo versátil e de fáci l manipulação facilitou imensamente o estudo da transcrição em eucariotos e permitiu que Kornberg realizasse todo o seu trabalho que culminou no prêmio Nobel. No final dos anos 1980, Kornberg purificou o complexo de transcrição de levedura que continha a RNA polimerase II e os cinco fatores gerais de transcrição. Interessantemente, verificou que em um sistema reconstituído que continha esse complexo de transcrição, apenas níveis de transcrição basais eram observados, e que o sistema não era responsivo à adição de fatores de ativação tecido-específicos. Essa observação levou Kornberg à inesperada descoberta e purificação de um grande complexo, denominado de mediador, composto de cerca de 20 proteínas, cuja presença é necessária para que ocorra a regulação da transcrição pelos fatores de ativação específicos. O mediador está ausente nas bactérias, mas está presente em todos os eucariotos, desde leveduras até mamíferos.

Desta maneira, foram determinados os três componentes necessários para que ocorra a transcrição em eucariotos (Figura 2): os fatores gerais de transcrição, o mediador e a RNA polimerase II. Nas bactérias, os ativadores e repressores de transcrição contactam diretamente a RNA polierase, afetando assim a sua ligação ao promotor. Nos eucariotos, a interação desses fatores regulatórios com a RNA polimerase ocorre através de fatores intermediários, o mediador e a cromatina, ausentes nas bactérias, permitindo um maior grau de complexidade na regulação da transcrição.

Apesar de identificados os componentes necessários à transcrição em eucariotos, pouco se sabia a respeito dos aspectos químicos estruturais envolvidos neste processo. Kornberg decidiu determinar a estrutura atômica da RNA polimerase II, que deveria representar a plataforma central do complexo de transcrição. Para cumprir esta missão precisou vencer grandes dificuldades técnicas, já que além de possuir um grande tamanho (0,5 × 10⁶ daltons)¹, a RNA polimerase II está presente em pequenas quantidades na célula e, quando purificada, apresenta baixa estabilidade. Após 20 anos de experimentos nos quais técnicas de microscopia eletrônica e cristalografia de raios X foram utilizadas, Kornberg determinou com sucesso a estrutura cristalográfica da RNA polimerase II com uma resolução de 2,8 Å. Uma estrutura de menor resolução (3,3 Å) onde a RNA polimerase II foi flagrada no ato da transcrição também foi determinada.

Os ácidos nucléicos ocupam uma fenda profunda formada por duas subunidades da enzima, que são conectadas por uma ponte formada por uma alfa-hélice (Figura 3). Acredita-se que essa alfa-hélice oscila entre uma forma estendida e uma forma dobrada, o que causaria o deslocamento do híbrido DNA-RNA através da fenda, ao longo da transcrição.

Durante a transcrição, a RNA polimerase II deve se ligar ao DNA e mover-se por longas distâncias sobre ele – milhares de nucleotídeos - sem se soltar, até alcançar o sítio de terminação de transcrição do gene. Os resultados mostram que uma região da RNA polimerase II forma uma estrutura na forma de um grampo, que se encontra na forma aberta quando a enzima está na forma livre, mas que se fecha ao redor do DNA quando a síntese de RNA inicia e o híbrido DNA-RNA se encontra no sítio ativo. Quando a síntese termina, o grampo se abre novamente, liberando a enzima.

Os estudos de Kornberg permitiram pela primeira vez a compreensão dos mecanismos estruturais que determinam o início da transcrição. O próximo grande passo será resolver a estrutura da RNA polimerase II complexada aos outros vários fatores de transcrição que regulam a transcrição gênica. Desta maneira poderemos compreender como esses fatores realmente interagem com a RNA polimerase. Esses estudos estruturais poderão trazer benefícios práticos também. Se pudermos, por exemplo, identificar diferenças na maneira com a qual as polimerases humanas e as de procariotos interagem com o DNA ou aos fatores de transcrição associados, poderemos desenvolver antibióticos que inibam a transcrição especificamente em patógenos. Uma outra possibilidade seria identificar drogas que inibam a ligação de fatores de transcrição que induzem crescimento celular à RNA polimerase II, já que esses fatores representam alvos potencias para terapias para o tratamento de câncer.

1. Na área de Bioquímica, é bastante comum denominar de dalton a unidade de massa atômica (u).